Принцип метода MicroArray.
MicroArray – микроматрица, в ячейках которой закреплены одно-цепочные молекулы ДНК, комплементарные к искомым. Матрица нанесена на стеклянной подложке; реакционные области (с молекулами ДНК) выглядят микроскопическими круглыми точками и расположены в строгом порядке. Флуоресцентная метка привязана к молекулам праймера, который необходим для ПЦР амплификации. С целевыми молекулами в реакционных областях связываются умноженные (ПЦР) молекулы ДНК пациента, отмеченные флуоресцентной меткой. Таким образом, флуоресцентный сигнал проявляется только в тех реакционных областях, участки ДНК которых содержатся и в реакционных областях, и в образце пациента.
Каждая реакционная область на слайде состоит из 24 пар точек, позволяющих выявить 24 разных фрагмента ДНК «в дублях».
На каждом слайде 5 реакционных областей – т.е. можно работать с 5-ю образцами одновременно.
Пошагово процедура выглядит следующим образом.
1 – Подготовка образца. ДНК пациента необходимо выделить из крови пациента. Для этого используется DNA isolation kit.
2 – ПЦР – умножение целевых фрагментных ДНК и связывание с флуоресцентной меткой. Праймеры с целевыми фрагментами ДНК поставляются готовыми к применению, в составе тестового набора.
3 – Гибридизация ДНК – готовый к использованию буфер для гибридизации поставляется в наборе. Буфер добавляется к образцу и раскапывается на реагентный лоток, который после покрывается слайдами с реакционными областями (технология TITERPLANE). Благодаря гидрофобному покрытию слайдов (между реакционными областями) капли не растекаются и не смешиваются. Происходит гибридизация умноженных и отмеченных фрагментов ДНК и их связывание с комплементарными фрагментами молекул, закрепленными в реакционных областях на слайдах. Процедура проводится в течение 60 мин. при 45 градусах, с использованием “hybridization station”.
4 – Считывание флуоресцентного сигнала из реакционных областей. Для считывания применяется прибор MicroArray Scanner, совместно с программой EUROArrayScan. Считывание результатов 5-ти образцов занимает 20 секунд. По полученным данным автоматически формируется протоколы с результатами.
Некоторые тестовые наборы позволяют сократить время на экстракции ДНК с помощью «EUROArray Direct».
В таком случае, вместо DNA isolation kit, в тестовом наборе содержатся экстракционные буферы Е1 и Е2. Общее время на подготовку 40 образцов — порядка 20 мин.
Оборудование, необходимое для выполнения процедуры:
YG 0601-0101 MicroArray Scanner (программа поставляется в комплекте)
YG 0631-0101 Incubator insert (рамка для установки лотка в hybridization station)
ZM 9999-0105 TITERPLANE reagent tray
